Новый стандарт точности в NGS: секвенатор S100, Cygnus

Развитие технологии массового параллельного секвенирования NGS в последнее 10-летие значительным образом расширило возможности исследований в фундаментальной биологии и медицине, прежде всего, за счет снижения стоимости секвенирования на несколько порядков по сравнению с секвенированием по Сэнгеру.

Несмотря на значительное улучшение производительности приборов, уровень ошибок NGS секвенирования практически не изменился. Точность всех аналитических измерений, включая секвенирование ДНК, зависит от соотношения между истинным значением и значением, полученным с помощью метода обнаружения. Это аналогично съёмке на цифровую камеру: при низком соотношении сигнал/шум, изображение нечеткое (Рис.1), но с повышением качества сенсора (Рис.2) появляется возможность увидеть сигнал от истинных объектов и снизить неспецифический шум. Для приложений NGS, требующих высокой точности, были разработаны методы фильтрации данных, способы уменьшения ошибок в консенсусной последовательности, однако фоновые ошибки самих платформ секвенирования второго поколения по-прежнему ограничивают обнаружение низкочастотных вариантов.

Рис. 1	Рис. 2

В настоящее время превалирующий подход секвенирования в NGS — это секвенирование путем синтеза SBS (sequencing by synthesis), в котором прочтение матричной цепи происходит вследствие детекции определенного сигнала от встраивания нуклеотидов во время синтеза цепи. За исключением технологии PacBio, где синтез цепи мониторируется постоянно, во всех остальных SBS подходах процесс синтеза построен на циклических реакциях.

Все эти подходы могут быть далее разделены на 2 основные категории в зависимости от используемой флоуграммы: циклическая обратимая терминация CRT (Cyclic reversible termination. Напр.: Illumina/Solexa, Direct/Helicos) и присоединение единичных нуклеотидов SNA (Single Nucleotide Addition; Напр.: Roche/454, Ion Torrent).

В CRT подходах 3′-OH заблокирована и, следовательно, если нуклеотид был встроен в комплементарную цепь, дальнейшего удлинения цепи не происходит до отделения метки. В каждом реакционном цикле подается 4 нуклеотида, ковалентно сшитых со своими флуоресцентными метками, и только одна база, удлинившая цепь, может быть определена в цикле.

В подходе SNA в каждом цикле в реакцию вводится только один нуклеотид с открытой 3′-OH группой. Элонгация происходит, когда предлагаемый нуклеотид комплементарен матрице.

У обоих подходов есть свои преимущества и недостатки. CRT используют флуоресценцию, которая стабильна, высокоэффективна в плане сигнализирования о встроившемся нуклеотиде. Однако комплексность и несовершенство реакционной химии, вызывающее молекулярное шрамирование (molecular scars) на растущей цепи после удаления флуоресцентной метки, приводит к ошибкам в секвенировании и лимитирует длину прочтения.

Большим преимуществом SNA является то, что продуктом реакции является нативная ДНК без терминирующих групп или шрамов, оставленных отщепившимися метками, в теории давая возможность получения более длинных ридов. Однако детектируемый сигнал в современных приборах по технологии SNA транзиентный и имеют плохую линейность между интенсивностью сигнала и числом dNTP, включенных в один цикл реакции в гомополимерных областях.

Информация для заказа: