От общности микробиома к частности раманома единичных клеток

Геном, метаболом и… рамано́м?

В последние годы всё больше и больше учёных признают эффективность омиксных подходов в изучении биологических процессов. Подобные подходы подразумевают изучение больших массивов данных, собранных на разных уровнях биологических процессов, и, как результат, мы имеем такие области науки как: геномика, протеомика, метаболомика, метагеномика, феномика и транскриптомика. Но среди этих омиксных технологий можно выделить еще одно направление, использующее спектроскопию комбинационного рассеяния (или Раман-спектроскопию). И в некоторых научных публикациях уже можно встретить такой термин как рамано́м /ramanome.

Под рамано́мом подразумевается совокупность Раман-спектров комбинационного рассеяния, характеризующую популяцию клеток. По сути, рамано́м – это совокупность Раман спектров единичных клеток (Single-cell Raman Spectra или SCRS). Именно этот Раман-спектр единичной клетки является своеобразным «отпечатком пальца», который может характеризовать уникальность той или иной клетки и может являться её уникальным идентификатором. Эту уникальную спектральную картину будут формировать такие соединения, как метаболиты клетки, ферменты, структурные элементы клетки и т.д. Каждый SCRS может иметь до 1500 пиков Раман-спектра, в то время как каждый пик или комбинация пиков могут потенциально представлять метаболический фенотип конкретной клетки и максимально отображать метаболический феномен системы с разрешением на уровне одной клетки в определенном состоянии. Примечательно, что в пределах рамано́ма, даже если геномы клеток идентичны, SCRS клеток могут быть различны; такая межклеточная гетерогенность SCRS является неотъемлемой чертой клеточных систем и имеет решающее значение для анализа и интерпретации отдельных клеток.

Таким образом, изучая Раман-спектр единичных клеток мы получаем, с одной стороны, информацию о характеристике фенотипа единичной клетки, о наличии тех или иных соединений в клетке (например наличие факторов антибиотикорезистентности бактерий или редких ферментов), и, с другой стороны, сложив данные о всех клетках, мы можем получить рамано́м данной популяции клеток, оценить гетерогенность данного пула клеток и выделить субпопуляции клеток.

Преимущество метода Раман-спектроскопии при работе с живыми клетками в том, что он не деструктивен по отношению к клеткам (не требует разрушения), не требует использования меток, минимально влияет на жизнеспособность клеток и, что особенно ценно, позволяет работать на уровне единичных клеток. Этот метод применим как для работы с бактериальными клетками, так и с клетками млекопитающих.

Так как же можно использовать данные о раман-спектре единичной клетки и как использовать эти «отпечатки пальцев»? Да также, как и в нашей с Вами жизни: для розыска искомых объектов и их задержания! И для опознания и задержания «особо разыскиваемых» клеток нам поможет система сортинга FlowRACS.

Система FlowRACS — это сортер клеток, который, в отличие от классического FACS-сортера, использует в качестве системы детекции и идентификации клеток в потоке Раман-спектрометрию. Система FlowRACS уникальна тем, что сочетает в себе сразу 3 технологии (pDEP, DLD, RACS), позволяющих идентифицировать и собрать клетки, обладающие уникальным фенотипом.

• RACS (Raman Activated Cell Sorting) — анализ молекулярного состава клеток с помощью рамановской спектроскопии и идентификация объекта на основе уникальных молекулярных отпечатков;
• pDEP (positive Dielectrophoresis) — положительный диэлектрофорез позволяет манипулировать клетками на основе их диэлектрических свойств и направлять их к определенным микрофлюидным каналам;
• DLD — детерминированное латеральное смещение — использует микроструктуры для сортировки клеток по размеру, что позволяет физически разделять клетки внутри микрофлюидного устройства.

Такой подход позволяет определять характеристики клеток на основе метаболических феномов и сортировать их на высокой скорости, без маркировки или окрашивания клеток, что позволяет увеличить жизнеспособность сортированных клеток.

«Опознание» происходит на основании заданных оператором Раман-спектров единичных клеток. Если клетка соответствует заданному спектру (например, содержит ферменты или вещества, которые нам интересны), то она идентифицируется как положительная и отбирается в пробирку. Если клетка не соответствует спектру, то она утекает в бак с отходами. Что касается способа сортировки объектов, то в системе FlowRACS используется метод положительного диэлектрофореза — pDEP. По итогу опознания, клетка получает заряд и может быть собрана в отдельную пробирку.

Такой комбинированный подход позволяет выявить и изолировать уникальные объекты, например единичные бактериальные клетки, которые вырабатывают уникальный фермент. При этом для «опознания» нет требуется разрушать клетки, что увеличивает возможность последующего культивирования для дальнейшего изучения или секвенирования «уникума».

Видео "Сортер клеточный FlowRACS с Раман детектором, Single Cell Biotech"

Где же применить такое уникальное технологическое решение?

В первую очередь эта система будет интересна микробиологам и эпидемиологам, поскольку позволяет анализировать и изолировать антибиотико-резистентные штаммы патогенных микроорганизмов, для последующего изучения и решения проблемы антибиотикорезистентности.

Также эта система будет интересна лабораториям, работающим в области R&D и занимающимися поиском и получением новых штаммов микроорганизмов. Система FlowRACS позволит найти и изолировать бактерии, которые содержат нужный фермент или соединение, для последующего культивирования и изучения. Если данный объект не культивируется — не беда: отсортированные клетки можно отправить на секвенирование, и используя эти данные можно синтезировать плазмиду для дальнейшего использования и создания штамма-продуцента.

Рис. 2. Workflow of scRACS-Seq/Culture for revealing organic-PSM in the sewage that links genotype to phenotype (metabolic activity)

Рис. 3. Идентификация отдельных клеток, тесты на жизнеспособность и жизнеспособность, быстрая идентификация, определение жизнеспособности in situ с разделением по видам, тест на чувствительность к антибиотикам.

Дополнительная информация

• Применение FlowRACS для высокопроизводительного изучения клеточных ферментов.
• Сортировка капель, активируемая Раманом, на основе положительного диэлектрофореза для скрининга (PubMed : 32821836).
• Метаболический феномен и геном отдельной клетки с помощью технологической платформы раманома.
• Рамановская спектроскопия отдельных клеток для сортировки и визуализации клеток (PMID: 22138495).

См также:

Ниже вы можете задать вопрос или оставить запрос в свободной форме: