Набор реагентов TSAPLus предназначен для двойной иммунофлуоресцентной окраски тремя цветами (IF488+ Red IF555 и DAPI) парафиновых срезов, в частности для двойной флуоресцентной иммуноразметки первичных антител из одного источника, а также для иммуноразметки антител из разных источников.
Основной принцип состоит в технологии усиления сигнала тирамида (TSA, Tyramide Signal Amplification). Принцип TSA заключается в применении пероксидазной реакции тирамида (флуоресцентно меченая соль тирамида образует ковалентную связь с участками связывания под действием HRP-катализированного пероксидом водорода (H₂O₂)), что приводит к множественным ферментативным реакциям. Продукт связывается с окружающими белковыми остатками (в том числе триптофан, гистидин и тирозин), формируя большое количество флуоресцентных отложений в месте связывания антигена с антителом, что способствует усилению сигнала.
Множественное флуоресцентное окрашивание также возможно за счёт повторной иммуноразметки с использованием различных флуоресцентных тирамидаз.
Если сравнивать с другими флуоресцентными наборами двойного окрашивания TSA, данный набор заменяет FITC-Tyramide и CY3-Tyramide на iF488-Tyramide и iF555-Tyramide, обеспечивая сильнее и стабильнее флуоресцентные сигналы.
Данные спектра флуоресценции соответствующих флуоресцентных красителей в наборах TSA
|
Тип флуоресцентного красителя
|
Длина волны возбуждения (Em), нм
|
Длина волны испускания (Em), нм
|
|
DAPI
|
359
|
518
|
|
iF440-Tyramide
|
434
|
569
|
|
iF488-Tyramide
|
491
|
516
|
|
iF546-Tyramide
|
541
|
557
|
|
iF555-Tyramide
|
557
|
570
|
|
iF594-Tyramide
|
588
|
604
|
|
iF647-Tyramide
|
656
|
670
|
|
iF700-Tyramide
|
690
|
713
|
Условия хранения и транспортировки
Каждый компонент набора хранится при рекомендуемых условиях. Комплект транспортируется на влажном льду. Срок годности — 1 год.
Состав набора
|
Компонент
|
G1226-50T
|
G1226-100T
|
Температура хранения
|
|
iF488-Tyramide
|
25 мкл
|
2×25 мкл
|
-20
|
|
iF555-Tyramide
|
25 мкл
|
2×25 мкл
|
-20
|
|
Разбавитель тирамида
|
100 мл
|
2×100 мл
|
4
|
|
DAPI (готовый к использованию)
|
10 мл
|
20 мл
|
4
|
|
Гаситель аутофлуоресценции тканей
|
10 мл
|
20 мл
|
Комнатная температура
|
|
Антифлуоресцентный гаситель
|
5 мл
|
10 мл
|
-20
|
|
Руководство по продукту
|
1 шт.
|
-
|
-
|
Подготовка к эксперименту
- Приготовить 0,01 М фосфатно-солевой буфер (PBS) (рН 7,0-7,4), 3% H₂O₂ и 0,3% H₂O₂.
- Приготовить первичные антитела и соответствующие HRP-меченные вторичные антитела, а также раствор для восстановления антигена (выбрать подходящий в зависимости от типа ткани и антитела).
- В соответствии с таблицей ниже приготовить рабочий раствор TSA для окрашивания.
|
Компонент
|
Объём
|
|
Раствор для окрашивания TSA-488
|
|
|
Разбавитель тирамида
|
1 мл
|
|
0,3% H₂O₂
|
10 мкл
|
|
iF488-Tyramide
|
2 мкл
|
|
Раствор для окрашивания TSA-555
|
|
|
Разбавитель тирамида
|
1 мл
|
|
0,3% H₂O₂
|
10 мкл
|
|
iF555-Tyramide
|
2 мкл
|
Примечание:
- После размораживания флуоресцентного тирамида пробирку кратковременно центрифугируют, затем тщательно перемешивают.
- Раствор TSA готовится непосредственно перед использованием, хранится в тёмном месте при 4 °С и остаётся эффективным в течение 24 часов.
Экспериментальный протокол (пример для тканевых срезов)
- Обезвоживание и гидратация срезов.
- Реставрация антигена: в зависимости от используемого первичного антитела и типа ткани выбирают подходящий метод.
- Промывка PBS: 3 раза по 5 минут, затем нанесение защитной маркировки (используйте гидрофобный маркер для иммуногистохимии Pap Pen).
- Блокирование эндогенной пероксидазы: покрыть ткани 3% H₂O₂, инкубировать 25 минут в темноте при комнатной температуре. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
- Блокирование неспецифического связывания: нанести 3% BSA или сыворотку на 30 минут.
- Инкубация с первичным антителом: развести антитело в PBS, инкубировать в увлажнённой камере при 4 градусах на ночь. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
- Инкубация с HRP-меченным вторичным антителом: развести в PBS, инкубировать 50 минут при комнатной температуре. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
- Окрашивание TSA-488: нанести 50-100 мкл раствора, инкубировать 10 минут в темноте. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
- Тепловая обработка в микроволновке: помещают срезы в буфер восстановления антигена, нагревают до 95 градусов на 15 минут.
- Повторная инкубация со вторым первичным антителом: аналогично шагу 6.
- Повторная инкубация с HRP-меченным вторичным антителом: аналогично шагу 7.
- Окрашивание TSA-555: аналогично шагу 8.
- Окрашивание ядра DAPI: инкубация 10 минут в темноте, промывка PBS.
- Гашение аутофлуоресценции (опционально): обработка судановым черным (Sudan Black B) 5 минут, промывка проточной водой 3 минуты.
- Закрепление и микроскопия: нанести антифлуоресцентный гаситель, запечатать срез, наблюдать под флуоресцентным или конфокальным микроскопом.
Примечания
- По сравнению с флуоресцентными вторичными антителами, набор TSA обеспечивает высокую чувствительность и мощный сигнал, поэтому концентрацию первичного антитела следует уменьшить в 5-10 раз по сравнению с обычными рекомендациями.
- При сильном фоновом свечении добавить этап гашения аутофлуоресценции.
- Рекомендуемое разведение флуоресцентного тирамида — 1:500 (можно варьировать от 1:200 до 1:1000).
- При множественной флуоресцентной окраске сначала инкубируют поликлональное антитело, затем моноклональное. Также сначала обрабатывают высокоэкспрессируемые белки, затем низкоэкспрессируемые.
