Набор предназначен для многоцветного иммуногистохимического флуоресцентного окрашивания (iF488, iF555, iF647 и DAPI) парафиновых срезов, особенно для иммуноокрашивания первичных антител из одного источника.
Принцип работы набора основан на технологии усиления сигнала тирамида (TSA). В процессе каталитической активности HRP (хреновой пероксидазы) флуоресцентно-меченный тирамин также катализируется, его продукты связываются с белковыми остатками (триптофан, гистидин, тирозин) в области связывания антигена и антитела, что усиливает сигнал.
Этот набор использует флуоресцентные красители 488/555/647 для мечения тирамида. Полученные флуоресцентные молекулы обеспечивают стабильный и яркий сигнал, что позволяет проводить повторное иммуномечение для многократного флуоресцентного окрашивания.
Флуоресцентный спектр используемых красителей
|
Флуоресцентно-меченный тирамид
|
Длина волны возбуждения (Ex), нм
|
Длина волны эмиссии (Em), нм
|
|
FITC-Tyramide
|
492
|
518
|
|
CY3-Tyramide
|
555
|
569
|
|
iF488-Tyramide
|
491
|
516
|
|
iF555-Tyramide
|
557
|
570
|
|
iF647-Tyramide
|
656
|
670
|
Условия хранения и транспортировки
Каждый компонент набора хранится при рекомендуемых условиях. Комплект транспортируется на влажном льду. Срок годности — 1 год.
Состав набора
|
Компонент
|
Артикул
|
Объем (50T)
|
Объем (100T)
|
Условия хранения
|
|
iF488-Tyramide
|
G1236-1
|
25 мкл
|
50 мкл
|
-20
|
|
iF555-Tyramide
|
G1236-2
|
25 мкл
|
50 мкл
|
-20
|
|
iF647-Tyramide
|
G1236-3
|
25 мкл
|
50 мкл
|
-20
|
|
Буфер разведения тирамида
|
G1236-4
|
100 мл
|
2×100 мл
|
4
|
|
DAPI (готовый к использованию)
|
G1236-5
|
10 мл
|
20 мл
|
4
|
|
Гаситель аутоглюоресценции (Раствор A)
|
G1236-6
|
10 мл
|
20 мл
|
Комнатная температура
|
|
Гаситель аутоглюоресценции (Раствор B)
|
G1236-7
|
10 мл
|
20 мл
|
Комнатная температура
|
|
Антифлуоресцентный монтирующий агент
|
G1236-8
|
5 мл
|
10 мл
|
-20
|
|
Инструкция
|
–
|
1 шт.
|
1 шт.
|
–
|
Подготовка к эксперименту
- Приготовьте 0,01 моль/л PBS (pH 7,0-7,4) (рекомендуется G4202 или G0002), 3% H₂O₂ и 0,3% H₂O₂.
- Подготовьте первичные антитела, соответствующие HRP-меченные вторичные антитела и раствор для восстановления антигена (подбирается в зависимости от антитела и типа ткани).
- Подготовьте рабочие растворы TSA в соответствии с таблицей:
|
Рабочий раствор
|
Буфер разведения тирамида
|
0,3% H₂O₂
|
Флуоресцентный тирамид
|
|
TSA-488
|
1 мл
|
10 мкл
|
2 мкл iF488-Tyramide
|
|
TSA-555
|
1 мл
|
10 мкл
|
2 мкл iF555-Tyramide
|
|
TSA-647
|
1 мл
|
10 мкл
|
2 мкл iF647-Tyramide
|
Примечание: перед использованием центрифугируйте флуоресцентный тирамид. Готовый рабочий раствор храните при 4 градусах в темноте, использовать в течение 24 часов.
Применение
- Подготовка образца: депарафинизация и регидратация тканевого среза стандартным методом IHC.
- (Опционально) Восстановление антигена: обработка ткани в растворе для восстановления антигена, затем промывка PBS (3×5 мин).
- Ограждение области ткани: используйте гидрофобный маркер для иммуногистохимии Pap Pen.
- (Опционально) Гашение аутоглюоресценции: нанесение 100 мкл раствора A на 30 мин, затем промывка.
- Блокирование эндогенной пероксидазы: 3% H₂O₂ на 25 мин в темноте.
- Блокирование неспецифического связывания: 100-150 мкл 3% BSA или сыворотки на 30 мин.
- Окрашивание 1-м флуорофором (488)
- Инкубация с первичным антителом (4 градуса, в темноте).
- Промывка PBS (3×5 мин).
- Инкубация с HRP-меченным вторичным антителом (50 мин, комнатная температура).
- Промывка PBS (3×5 мин).
- Инкубация с TSA-488 (10 мин в темноте), затем промывка.
- Тепловая обработка: удаление антител и повторное окрашивание вторым антителом.
- Окрашивание 2-м флуорофором (555): повторение шага 7 с TSA-555.
- Окрашивание 3-м флуорофором (647): повторение шага 7 с TSA-647.
- Контрастное окрашивание ядер: 100-150 мкл DAPI (10 мин, в темноте).
- Промывка PBS (3×5 мин).
- (Опционально) Повторное гашение аутоглюоресценции: обработка раствором B (30 мин), затем промывка.
- Анализ: монтирование покровного стекла с антифлуоресцентным агентом и визуализация на микроскопе.
Примечания
- Последовательность окрашивания (488, 555, 647) можно менять.
- Оптимизируйте условия эксперимента для максимальной специфичности сигнала.
- Возможные проблемы и их решения:
|
Проблема
|
Решение
|
|
Сильный сигнал
|
Уменьшите концентрацию антител/тирамида, сократите время инкубации.
|
|
Слабый сигнал
|
Увеличьте время инкубации, скорректируйте разведение антител.
|
|
Высокий фон
|
Продлите блокирование и промывки, уменьшите концентрацию антител.
|
