Амплификатор, также называемый термоциклером — это прибор, используемый в молекулярной биологии для амплификации ДНК методом ПЦР (некоторые методики позволяют также амплифицировать РНК).
Сущность процессов, реализуемых в амплификаторе
По сути, это программируемый термостат, который можно настроить на циклическое повторение программы нагревания и охлаждения пробирок для осуществления следующих процессов:
денатурации при температуре 94–98 °С с превращением двухцепочечной молекулы ДНК в две одноцепочечные за счет разрушения водородных связей;
присоединения при 40–75 °С праймеров — особым образом подобранных коротких фрагментов ДНК, комплементарных ее определенным участкам, с которых начинается образование новой цепи. Этот процесс называют «отжигом», а для отжига праймеров только с нужными участками ДНК учитывают их температуру плавления — расчетную температуру, при которой половина праймеров комплементарно связывается с целевым участком ДНК. Температура отжига должна быть 1 – 5 °С ниже температуры плавления, но не превышать оптимальную температуру работы полимеразы. Этот диапазон определяется на уровне 40–75 °С;
элонгация — собственно синтез новой цепи ДНК — при температуре 60–75 °С. Максимальная скорость этого процесса составляет 50–60 нуклеотидов в секунду, но обычно продолжительность этой стадии задают из расчета 1 минута на тысячу пар нуклеотидов.
Каждая новая молекула ДНК вместе с исходной становится матрицей для синтеза в очередном цикле: в результате количество целевого продукта реакции накапливается экспоненциально с ростом количества циклов. По окончании процесса количество продукта таково, что его можно детектировать доступными методами — либо проведением гель-электрофореза, либо использованием специальных красителей.
Необходимое количество циклов, а также нужные температурные и временные характеристики для каждого процесса можно выбрать в соответствии в выполняемой задачей. При этом необходимо обеспечить точность изменения температуры не менее 0,1 °C, а скорость нагревания или охлаждения — на уровне от 2 до 10 °C в секунду.
Скорость изменения температуры и точность ее поддержания — основные параметры амплификатора, от которых зависит скорость ПЦР и ее качество — точность копирования ДНК.
Работа ведется одновременно с десятками пробирок или планшетами, рассчитанными на разное количество лунок, и важно, чтобы все эти емкости нагревались с одинаковыми параметрами вне зависимости от того, находятся в центре или по краям.
Исключение — режим градиентного нагрева, обычно используемый для подбора оптимальных условий реакции.
Типы амплификаторов
Амплификаторы подразделяются на несколько типов по способу детекции накапливающихся продуктов реакции:
«классические амплификаторы , в которых детекция ведется по конечной точке;
амплификаторы «в реальном времени », которые могут фиксировать изменение интенсивности флуоресценции в ходе реакции с использованием интеркалирующих красителей. При выборе этих приборов следует обратить внимание на количество каналов измерения флуоресценции: их может быть от 2 до 6, и в зависимости от этого параметра можно использовать один, два флуорофора или реализовать мультиплексную ПЦР; амплификаторы для изотермической ПЦР методом LAMP (loop-mediated isothermal amplification), использующего особую Bst-полимеразу, позволяющую проводить амплификацию при 60–65 °С, минуя стадию денатурации (также доступен метод RT-LAMP, включающий обратную транскрипцию и используемый для амплификации РНК). При этом используется 4-6 праймеров, этот метод имеет высокую специфичность, но рассчитан на получение результата «позитив»/«негатив» без количественной оценки;отдельный класс систем — амплификаторы цифровой (капельной ) ПЦР .
Что учесть при выборе амплификатора
Пользователю важно соотнести задачи лаборатории и характеристики основных узлов прибора — термоблока, систем термостатирования и управления.
В термоблоке (реакционном блоке) фиксируются реакционные сосуды, которые нужно нагревать и охлаждать — как правило, отдельные или объединенные в стрипы одноразовые пластиковые пробирки или планшеты с разным количеством лунок — 16, 30, 48, 60, 96 или 384.
Наиболее распространен планшетный формат на 96 мест для пробирок по 0,2 мл, но для крупных лабораторий больше подойдет блок на 384 места, а для небольших лабораторий пригодятся блоки на 16 и 48 мест. Есть также блоки для больших (0,5 мл) или меньших (0,1 мл) объемов реакционной смеси.
ВАЖНО: если у лаборатории очень большая пропускная способность, полезной функцией будет возможность объединить несколько амплификаторов в одну станцию, управляемую с одного прибора.
Пользующиеся наибольшей популярностью твердотельные термоблоки из сплава с высокой теплопроводностью имеют углубления под реакционные сосуды. Роторный вариант способен только фиксировать сосуды и обеспечивать воздушное термостатирование. Для этого узла важна высокая теплопроводность и способность обеспечивать однородную температуру (в лучших моделях до 0,1 °C).
В современных приборах термоблоки имеют нагреваемую крышку Hotlid («горячая крышка»). Она препятствует испарению реакционной смеси, а плотность контакта пробирок с термоблоком и этой крышкой обеспечивается прижимом, регулируемым вручную или электромеханически. Эта крышка может иметь откидное исполнение либо быть частью выдвижного термоблока и располагаться внутри устройства.
Если у прибора (как правило, устаревшей модели) такой крышки нет, поверх реакционной смеси требуется наносить специальное минеральное масло или воск для предотвращения испарения образца, но это неудобно, если с образцом предполагается дальнейшая работа.
ВАЖНО : Если на термоблоке установлено несколько нагревательных элементов Пельтье, пользователь может одновременно проводить реакции с разными температурными параметрами цикла.
Система термостатирования в современных амплификаторах реализована с использованием элементов Пельтье с теплообменником и вентилятором. Это дает максимальную скорость изменения температуры, снижает зависимость от температуры помещения и повышает надежность и компактность конструкции. Обычно элементы Пельтье и радиатор объединены в единый блок, а вентилятор располагается отдельно. Хорошо, если в приборе есть конструкционная возможность для пользователя заменять термоблок самостоятельно.
Более ранние решения предусматривали использование водяных бань, твердотельных блоков с фиксированной температурой для каждого (с механическим переносом реакционных сосудов между ними), резистивного нагрева и охлаждения воздухом (обдува или пассивного), проточной водой либо холодильной установкой. У всех этих решений есть свои преимущества и недостатки.
Система управления амплификатором обычно представлена встроенным микрокомпьютером, контролирующим температурный режим в соответствии с выбранной программой. В этом процессе задействованы температурные датчики термоблока и программный аппарат, обеспечивающий нужную температуру и скорость ее изменения, а также однородность нагрева. Пользовательский интерфейс реализован в виде клавиатуры и дисплея, отображающего информацию о выбранной программе, ее текущей стадии, установленных и текущих температурных показателях. На графическом дисплее эти данные отображаются в формате диаграммы. Как правило, амплификаторы «продвинутых» моделей оснащены цветными сенсорными дисплеями сродни мобильным гаджетам, а также присутствует возможность подключить прибор к внешнему компьютеру — тогда можно не только управлять прибором, но и вести рабочие журналы. Простейшие приборы управляются только с внешнего компьютера.
Возможность подключения принтера позволяет распечатывать рабочие протоколы в соответствии с надлежащей лабораторной практикой. Кроме того, все чаще амплификаторы оснащаются USB портом для подключения съемного носителя, что позволяет и расширить объем внутренней памяти, и выполнять импорт/экспорт программ амплификации. Некоторые модели имеют также интерфейс Bluetooth.
Для повышения надежности работы прибора и снижения риска срыва эксперимента вследствие перебоев в электроснабжении рекомендуется эксплуатация амплификатора с источником бесперебойного питания.
ВАЖНО : Несомненным преимуществом при выборе амплификатора будет наличие у него регистрационного удостоверения Росздравнадзора и свидетельства об утверждении типа средств измерений.
